摘要：目的对当归不同炮制品中大肠埃希菌变化进行定量分析。方法建立荧光定量PCR方法，对当归不同炮制品、不同产地、不同收集企业、不同储藏时间的大肠埃希菌进行定量分析。结果不同炮制品中大肠埃希菌数量变化为生当归＞土炒当归＞酒当归；在不同产地的当归中以甘肃岷县地区所含的大肠埃希菌的数量最少；与零售企业相比，生产销售企业的当归和酒当归中大肠埃希菌的数量较少；不同储藏时间对当归和酒当归中大肠埃希菌数量有一定影响，随储藏时间的增加，大肠埃希菌的数量也在增加。对部分代表性样品进行平板计数法与荧光定量PCR法比较时发现，平板计数法结果多呈阴性，荧光定量PCR结果均呈阳性。结论所建立的荧光定量PCR法特异性、灵敏度、可靠性以及报告周期均优于平板计数法，可为当归不同炮制品中大肠埃希菌的快速、准确定量检测提供有效手段。

当归为伞形科植物当归Angelicasinensis(O1iv.)Diels的干燥根，其根入药在我国已有余年的历史，应用非常广泛，医家喻为“群药之首”，病家称为“治补两益”[1]。当归具有补血活血、调经止痛、润肠通便之功效[2]，现代药理学研究表明，当归还具有多种药理作用[3-5]。年中华人民共和国国家卫生和计划生育委员会将当归纳入药食两用的品种目录中。基于古人对药食两用品种的4种主要特征认识：安全、营养、保健和治疗作用，其安全性尤为重要[6]。

大肠埃希菌Escherichiacoli(T.Escherich)是人和动物肠道中的常居菌，广泛传播于自然环境中。大肠埃希菌大多为条件致病菌，只有某些血清型毒株的毒力较强，可引起带血腹泻、腹绞痛、发烧、呕吐、膀胱炎、阑尾炎等表现，严重危害人类健康[7-9]。因此，大肠埃希菌是中药制品微生物限度检查中常需要检测的控制菌。传统培养计数法中常用的大肠菌群MPN计数法和大肠菌群平板计数法虽是鉴定和检测大肠埃希菌的“金标准”，但操作复杂且耗时较长，不适合大批量中药制品的检测。

随着分子生物学的发展，PCR技术已经广泛应用于致病菌的检测。荧光定量PCR是指在PCR反应体系中加入荧光基团或荧光染料，利用反应过程中荧光信号的强弱变化来实时监测特异性产物的量，最后通过已知拷贝数的模板建立的标准曲线对未知样品进行绝对定量分析的核酸定量技术[10-11]。与常规PCR相比具有明显优越的灵敏度、特异性和操作简单的特点，适合对大批量样品进行快速定量检测，可准确反映样品中大肠埃希菌的携带情况。本研究利用大肠埃希菌特异性引物扩增当归中大肠埃希菌的16SrDNA-V3区，以期建立SYBRGreenI实时荧光定量PCR检测当归大肠埃希菌数目的方法，为中药饮片微生物污染风险评估和微生物标准的制定提供数据支持。

1材料

1.1仪器与设备

FQD-48A（A4）型荧光定量聚合酶链反应（PCR）检测系统、TC-96/G/H（b）C梯度PCR仪，杭州博日科技有限公司；Allegra21R台式高速冷冻离心机，美国Beckman公司；AR电子天平，美国Ahoms公司；MultiTempIII恒温水浴锅、HoferMV-25紫外透射仪，美国AmershamPharmacia公司；SIM-FAY65雪花状制冰机，日本Sanyo公司；移液器，德国Eppendorf公司；SJ-CJ-1FD单人单面（垂直送风）洁净工作台，苏州苏洁净化设备有限公司。

1.2试剂及耗材

AxyPrepDNA凝胶回收试剂盒，美国Axygen公司；SoilPure超纯土壤基因组DNA快速提取试剂盒、零背景pTOPO-TA克隆试剂盒，北京艾德莱生物科技有限公司；SYBRPremixExTaqII（TliRNaseHPlus）试剂盒、HindIII，宝生物工程（大连）有限公司；DLDNAPlusMarker、1KbDNALadderMarker，南京诺唯赞生物技术有限公司；GeLStain，北京全式金生物技术有限公司；琼脂糖，西班牙Biowest公司。

1.3药物

所用当归经南京中医药大学药学院陈建伟教授鉴定为伞形科植物当归Angelicasinensis(O1iv.)Diels干燥根经不同炮制方法形成的饮片。其中S1～S35为生当归饮片，J1～J24为酒当归饮片，T1～T17为土炒当归饮片；S1～S8、J1～J8、T1～T8为甘肃禾驮乡产地饮片，S9～S13、J9～J13、T9～T13为甘肃岷县产地饮片，S14～S17、J14～J17、T14～T17为甘肃渭源产地饮片；S1～S24、J1～J19、T1～T17为生产销售企业饮片，其余为不同零售企业饮片；在生产销售企业中S1～S17、J1～J17、T1～T17的储藏时间较短，为8个月，其余储藏时间较长，S18～S24储藏时间约为15个月，J18～J19约为20个月；具体产地和生产时间见表1。

2方法

2.1当归微生物DNA提取

取当归样品（粉碎过三号筛）0.2g，按SoilPure超纯土壤基因组DNA快速提取试剂盒的试验步骤进行DNA提取。DNA样品于?20℃冰箱中保存，待用。

2.2引物的设计与合成

根据相应的文献报道[12-13]，利用引物设计软件Primerpremier5.0设计特异性引物，并将引物序列在Blast数据库中进行比对验证，见表2。引物委托

南京钟鼎生物技术有限公司合成。

2.3PCR扩增及电泳

PCR扩增体系为25μL：2×TaqPCRMasterMix12.5μL，模板1μL，引物F（10μmol/L）0.5μL，引物R（10μmol/L）0.5μL，10.5μLddH2O。PCR反应条件为94℃预变性5min；94℃变性30s，60℃退火30s，72℃延伸30s，共35个循环；72℃修复延伸7min。PCR产物经1.2%琼脂糖凝胶电泳检查，电泳条件为V恒压30min。通过凝胶成像系统分析试验结果。PCR产物用纯化试剂盒进行纯化，测定质量浓度。具体操作按照说明书进行。纯化产物用于随后的克隆实验。

2.4目的基因的TA克隆

取纯化的PCR产物0.5～8μL，Ptopo-TVector载体1μL，10×Enhancer1μL，ddH2O至10μL，轻轻混匀，室温（20～30℃）连接5min，将连接产物加入μLDH5α感受态细胞中进行重组质粒的转化，加入μL不含抗生素的LB培养基，混匀，37℃r/min振荡30min，使细菌充分表达。吸取复苏后细菌，均匀涂布到含抗氨苄青霉素（Amp）的琼脂培养基上，37℃倒置培养过夜，挑取平板中阳性单菌落，PCR检测，并送南京钟鼎生物技术有限公司进行测序。

2.5荧光定量PCR标准曲线、反应体系

挑选阳性菌株接种到含Amp的LB培养基中，37℃r/min摇菌过夜。提取质粒，通过单酶切后，回收酶切产物。使用微量分光光度计测得标准质粒的浓度，并计算出标准质粒原液中拷贝数浓度。对标准品进行10倍梯度稀释，然后以标准品为模板进行荧光定量PCR反应。反应完成时，以标准品浓度的对数为横坐标，阈值循环数Ct（即每个反应管内的荧光信号达到设定的阈值时所经历的循环数）为纵坐标绘制标准曲线。反应体系为SYBRPremixExTaqII（TliRNaseHPlus）10μL，正向引物、反向引物（10μmol/L）各0.8μL，模板/基因组DNA1μL，ddH2O至20μL。荧光定量PCR反应条件为：扩增曲线：94℃预变性30s；94℃变性10s，60℃退火12s，72℃延伸30s，循环45次，72℃单点检测信号；熔解曲线：72℃开始检测，以0.5℃为台阶温度停留15s采集荧光。

2.6大肠菌群平板计数方法

根据荧光定量PCR法测定结果，分别从生当归、酒当归以及土炒当归中选择具有代表性的样品进行平板计数法检测。称取25g样品，放入盛有mL生理盐水的无菌均质杯内进行稀释操作，所有操作需保证严格无菌，取上清液，即得样品匀液（1∶10）。用1mL微量移液器移取样品匀液1mL，沿管壁缓缓注入至含有9mL生理盐水的无菌试管中，振摇试管，使其混合均匀，制成1∶的样品匀液。按上述操作，依次制成10倍递增系列稀释样品匀液。取1∶10供试液及3个连续10倍稀释级，分别取1mL注皿，平行制备2个平皿，同时取1mL生理盐水加入无菌平皿作空白对照，在平皿中倒入15～20mL冷却至46℃的结晶紫中性红胆盐琼脂（VRBA），小心旋转平皿，将培养基与样液充分混匀，防止菌落聚团生长，无法计数。待琼脂凝固后，再加3～4mLVRBA覆盖平板表层。翻转平板，置于（36±1）℃培养18～24h。

3结果与分析

3.1DNA提取与PCR扩增

采用设计的大肠埃希菌引物对大肠埃希菌基因组DNA进行PCR扩增，结果（图1）显示能得到与预期片段大小相一致（96bp）的DNA条带。

3.2目的片段的克隆与鉴定

回收大肠埃希菌PCR产物、连接Ptopo-TVector后转化感受态细胞，挑取阳性单菌落，提取重组质粒进行PCR鉴定，结果与预期片段大小相一致。结果见图2。阳性重组质粒测序结果与GenBank上已知菌种相应序列进行比较，大肠埃希菌扩增片段序列与相应菌株的同源性高度一致，说明所得标准质粒为所需要的目的质粒。

3.3样品大肠埃希菌定量PCR的建立

以大肠埃希菌16SrDNA片段重组质粒的梯度稀释度为模板，进行实时荧光定量PCR扩增，得到大肠埃希菌的荧光定量扩增曲线（图3）、标准曲线（图4）以及熔解曲线（图5）。从图3可见，曲线较光滑，为典型的“S”形曲线，各循环阈值间隔均匀。从图4看出，大肠埃希菌16SrDNA片段重组质粒扩增效果较好，线性回归方程为Y＝?3.X＋35.，r2＝0.，表明在模板稀释范围内有很好的线性关系。从图5可以看出，梯度稀释样品熔解曲线呈现单一熔解峰，未出现其他杂峰，峰值出现在81.3℃，表明扩增反应产物特异性良好，且无引物二聚体影响；曲线平稳，说明各浓度质粒的熔解温度均一，扩增产物特异性好。

3.4样品中大肠埃希菌数目

本实验通过检测大肠埃希菌16SrDNA基因数目来反映当归中大肠埃希菌的数目。结果显示，所有当归样品中均含有大量的16SrDNA基因片段。考虑到大肠埃希菌中16SrDNA基因的拷贝数为7[14]，实验对绝对定量获得的数据进行计算处理，结果见表3。结果显示与生当归相比，酒当归和土炒当归中大肠埃希菌数量均有所减少，酒当归下降幅度较大。对不同产地当归中大肠埃希菌数量比较分析，发现当归不同炮制品中大肠埃希菌数量均以甘肃岷县最少。对生产销售企业以及不同零售企业的生当归和酒当归中大肠埃希菌数量进行比较分析，结果显示零售企业当归中大肠埃希菌数量多于生产销售企业的。同时对生当归和酒当归中不同储藏时间样品的大肠埃希菌数量进行考察分析，发现储藏时间短的样品，其大肠埃希菌数量相对较少。结果见图6。

3.5大肠菌群平板计数方法

选取菌落数在15～cfu/g的平板，计数平板上出现的典型和可疑大肠菌群菌落，大肠埃希菌典型菌落为紫红色，菌落周围有红色的胆盐沉淀环，菌落直径为0.5mm或更大。以计数的平板菌落数乘以稀释倍数，即为每克样品中大肠菌群数。实验结果表明，在选定的10个样本中仅有生当归样本中的S8和S27号检测出大肠埃希菌，且数量很少，其余均未检测出。结果见表4。

4讨论

4.1方法建立的合理性

目前，大肠埃希菌的新型检测方法有酶联免疫分析（ELISA）法[15]、环介导等温扩增（LAMP）技术[16]、基因芯片技术[17]、HPLC法[18]等；但ELISA法不具备广泛性，且易受待测物质含量、免疫原性、稳定性、结构等诸多因素干扰；LAMP法由于恒温条件无法进行多重扩增，还要选择合适的特异引物及尽量避免反应体系受污染等问题[19]；基因芯片技术和色谱测定局限性大且费用昂贵。本研究首次尝试利用荧光定量PCR检测体系建立当归不同炮制品大肠埃希菌的定量检测方法。由于16SrDNA是细菌的高度保守序列，其可变区在不同细菌之间存在一定程度的差异，具有细菌属或种特异性；选择可变区设计PCR特异性引物，则可将标本中的细菌鉴定到属甚至种的水平，是细菌鉴别较为理想的靶序列[20]。故本研究以大肠埃希菌16SrDNA为切入点，将PCR产物克隆至Ptopo-TVector载体上，抽提质粒梯度稀释制备标准品。大肠埃希菌的标准曲线线性回归方程为Y＝?3.X＋35.，r2＝0.；重组质粒PCR鉴定和测序分析，克隆序列与原标准菌株已知序列同源性高度一致，证实标准品构建成功[21]。熔解曲线是用来验证以SYBRGreenI为荧光染料的定量PCR扩增的特异性，利用SYBRGreenI指示双链DNA熔点的性质来分析产物的均一性，有助于更准确地分析PCR定量结果。根据前期实验结果，在采集荧光前设定一个临界温度81.3℃，使引物处于单链状态，扩增产物仍为双链结构，避免引物二聚体对产物荧光值的干扰从而使定量更为准确。

4.2当归不同炮制品中大肠埃希菌数量分析结果

当归不同炮制品中大肠埃希菌数量存在差异，酒炙和土炒均能减少大肠埃希菌的数量，推测其原因是该菌对热抵抗力较弱，经55℃加热60min或60℃加热15min即可杀灭大部分菌[22]，且炮制用辅料灶心土在储藏、运输等过程中也有可能被大肠埃希菌污染，从而在土炒过程中进一步污染当归样品，因此酒当归大肠埃希菌数量下降程度高于土炒当归。由此可联想到当归饮片在服用前经过煎煮或者冲泡，一方面可利于有效成分的溶出，另一方面通过加热的方式可对大肠埃希菌等致病菌有明显的杀灭作用。

4.3不同产地不同炮制品中大肠埃希菌数量分析结果

全国95%以上村庄都没有排水渠道及污水处理系统，农村地区污水多数以直排的形式入河或者排入坑塘自然下渗，从而造成河流、土壤及地下水污染[23]，同时由于我国水资源的紧缺，大面积的实施污水回灌利用[24]。在这种情况下，微生物可以通过地表和土壤进行迁移，继而污染地表水、土壤和地下水。大肠埃希菌在土壤中存活能力很强，Hagedorn等[25]通过现场试验发现大肠埃希菌可以在土壤中存活32d以上。在本实验中，当归不同炮制品中大肠埃希菌数量以甘肃岷县最少，说明在一定程度上甘肃岷县土壤微生物污染程度较小。

4.4不同收集企业不同炮制品中大肠埃希菌数量分析结果

与不同零售企业相比，生产销售企业可以在当归药材的种植、采收加工、炮制、运输和储藏等各方面对大肠埃希菌的数目进行控制，而零售企业在运输存储等过程中容易携带或引入大肠埃希菌，因此生产销售企业生当归和酒当归中大肠埃希菌的数量与零售企业相比较少。

4.5不同储藏时间不同炮制品中大肠埃希菌数量分析结果

大肠埃希菌自身生长繁殖速度很快，在营养丰富的培养基中繁殖一代不到20min[26]，因此，随着储藏时间的增长，样品中的大肠埃希菌经过繁殖生长，其数量也会增加，表明当归饮片从生产到消费之间时间间隔越久，受到的污染情况就会越严重。同时现代研究表明当归多糖有活血、调节免疫等显著的生理活性，是当归补血活血的药理成分之一，在药材和饮片质量研究中常会将其作为质量控制的指标[26-27]，而大肠埃希菌能够迅速分解多种糖类，如葡萄糖、乳糖、麦芽糖、甘露糖等，并能产酸产气[28]；也就是说当归中大肠埃希菌数量越多，对当归中多糖含量影响就越大，从而造成当归质量的降低与有效期的缩短。这也提示包括当归饮片在内的中药饮片应明确规定使用年限。

4.6荧光定量PCR法与平板计数法测定大肠埃希菌数量的差异

本研究比较了荧光定量PCR法与传统的平板计数法，结果显示荧光定量PCR结果均呈阳性，而平板计数法结果多呈阴性，且数量级较荧光定量PCR法低2～3个数量级，这与Castillo等[29]的研究结果一致。造成这种差别的原因可能有以下几点：一是当归样品中大肠埃希菌处于活的非可培养状态（VBNC）或样品中有活力的大肠埃希菌太少以至于培养方法不能分离得到；二是当归样品中可能存在一些灭活菌；三是当归饮片形状各异，可能难溶于水，在平板计数法中不易制成均匀的供试液，造成取样的不均匀性[30]；四是当归醇提取物和水提物、总黄酮醇提液以及当归的有效成分阿魏酸对大肠埃希菌有一定的抑菌作用[31-35]，在培养过程中也会杀灭部分大肠埃希菌。与传统的平板计数法相比，荧光定量PCR法不仅灵敏度高，检测周期短，操作简单，还可有效规避部分病原微生物高度变异而出现的大肠埃希菌假阳性结果，提高准确性；此外当归中的VBNC菌虽失去生长繁殖能力，但仍旧处于存活状态，保留原菌的毒力和致病性，对当归安全构成潜在的威胁[36]，荧光定量PCR对这种细菌的检测能力则可反映当归大肠埃希菌的携带能力。另一方面，当归经过杀菌虽会残存大量的灭活菌而被荧光定量PCR检测出，但当死活菌比例低于时，样品中的死菌不会影响定量结果[37]，故本研究在一定程度上可反映当归大肠埃希菌的携带情况。

本实验通过荧光定量PCR技术对当归中大肠埃希菌的数目进行定量分析，实验结果显示不同炮制方法、不同产地、不同收集企业以及不同储藏时间对大肠埃希菌的数量均有一定的影响，阐述了炮制、产地、包装、储存、运输的重要性；为当归饮片微生物污染风险评估提供一定数据支持。但本实验中也存在一些不足之处，其当归样品中大肠埃希菌死菌及其基因组DNA的干扰并未扣除，后续实验将采取叠氮溴化丙锭抑制样品中死菌基因组DNAPCR扩增的方式或其他样品前处理的方式从而避免假阳性的结果，更加准确反映样品中大肠埃希菌的携带情况。